目的 优化农杆菌介导的日本落叶松胚性愈伤组织瞬时转化体系。 方法 以液体增殖培养7 d的日本落叶松胚性愈伤组织为受体材料，利用携带β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的pCAMBIA1305.1载体进行瞬时转化，根据GUS的表达量及酶活性，筛选最佳侵染液浓度、侵染时间和共培养时间。并利用筛选出的转化体系，分析落叶松scarecrow-like 6（LaSCL6）启动子的活性。 结果 瞬时转化后，GUS表达明显。当侵染液浓度OD₆₀₀为0.2，侵染5 min，共培养72 h时，GUS的表达量最高，∆C_T值为-2.274 2；当侵染液浓度OD₆₀₀为0.05，侵染5 min，共培养72 h时，GUS酶活性最高，为25.7286 U·L⁻¹。LaSCL6启动子的活性是CaMV35S启动子的1.55倍。 结论 综合考虑GUS的表达量和酶活性，当侵染液浓度OD₆₀₀为0.05，侵染5 min，共培养24 h时，GUS的表达量和酶活性较高，这一条件可以用来进行日本落叶松胚性愈伤组织的高效转化。

对12年生日本落叶松自由授粉子代测定林纸浆材材质性状进行了遗传变异分析、遗传参数估计、相关分析及综合评价和选择。结果表明:家系间综纤维素含量、基本密度、早材和晚材纤维长度、早材和晚材壁腔比差异极显著或显著,10g·L-1NaOH抽出物差异也达10%水平显著。各性状受强度或中等强度的遗传控制,对日本落叶松进行家系水平的材性改良具有很大的潜力。木材密度与早、晚材壁腔比、10g·L-1NaOH抽出物呈显著正相关,与综纤维素含量呈显著负相关,与早、晚材纤维长度相互独立;晚材纤维长度与早材纤维长度存在紧密正相关,纤维长度与早材壁腔比存在显著负相关关系,与晚材壁腔比、综纤维素含量和10g·L-1NaOH抽出物相互独立;综纤维素含量与早材壁腔比呈显著负相关,与晚材壁腔比相关不显著;10g·L-1NaOH抽出物与综纤维素含量、早、晚材壁腔比均相互独立。根据对日本落叶松材质性状的综合评价结果,选出最适合作纸浆林培育的249、340、346、217和364号家系。

采用 311-A最优回归设计, 对落叶松胚性细胞诱导中激素种类与浓度优化筛选, 建立胚性愈伤组织量依 2, 4-D、BA、KT的多项式回归方程。分析了试验因子的主效应和互作效应, 借助此方程获得了 3因子的最佳配比组合以及最佳胚性愈伤组织发生量。 2, 4-D为 1.2 9mg· L-1、BA为0.39mg· L-1和 KT为 0.58mg· L-1时, 落叶松胚性愈伤组织的诱导量可达到 13.9317mg·个-1(外植体)。

以我国重要的生物能源灌木———中间锦鸡儿枝叶和种子为材料,根据GenBank中已经发表fad2基因的同源序列,利用PCR技术克隆得到基因片段。在GenBank中Blast (GenBank登录号AY957393)所得基因片段和同属豆科的Glycine max Gmfad2-2a同源性高达88% ,位于fad2基因编码区中部。将所得片段经BamH I和Sac I酶切后插入表达载体质粒pB I121,构建了反义表达载体pB I121fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片,获得了抗卡那霉素和氨苄青霉素的再生烟草植株。初步分析结果表明:与对照烟草相比,转基因烟草种子脂肪酸含量没有明显差异,而亚油酸则减少10. 3%。

综述了欧洲落叶松、日本落叶松、欧日和日欧杂种落叶松、西部落叶松和华北落叶松体细胞胚胎发生的研究进展,对胚性培养物的超低温保存、原生质体培养和基因转化等技术进行了介绍,并对落叶松体细胞胚胎发生的研究趋势作了展望。

应用IMAGING-PAM荧光仪测定了离体脱水胁迫不同时期梭梭和胡杨的叶绿素荧光动力学参数。结果表明:离体胁迫初期(3 h) Fv /Fm、qP和ETR轻微降低,但胡杨的降低幅度比梭梭大;而此时qN 却明显增加,胡杨的增加幅度远大于梭梭。随着离体时间的延长(6、12 h) ,胡杨的Fv /Fm、qP和ETR 明显降低,梭梭的降低幅度仍相对较小;而此时qN 呈降低趋势,梭梭低于对照水平,而胡杨仍旧高于对照。这也说明遭遇不同程度胁迫时,梭梭和胡杨启动了不同的过剩光能防御机制。

以落叶松未成熟合子胚诱导的16个胚性细胞系为材料,对继代培养的细胞系间及不同世代间染色体数目和体细胞胚胎发生率进行对比研究,结果表明:落叶松胚性细胞系随继代培养时间的增加,总体体细胞胚分化能力逐渐下降,平均体细胞胚分化率从继代培养第7次后的335.6个·g -1降低到第22次后的268.2个·g-1,细胞染色体数目变异率逐步增加,从5.4%上升到40.0%;不同细胞系间体细胞胚分化能力及稳定性差异明显,分化能力较高的细胞系染色体数目变异几率相应较小,在继代培养第25次后,细胞系a214染色体数目变异率为0%,体细胞胚分化率为416.1个·g -1。

以落叶松扦插生根率存在显著差异的2个全同胞优良无性系茎和根为材料, 应用抑制消减杂交技术构建了扦插生根过程中2个差异表达cDNA 文库, 酶切效率检测、连接效率检测、差减效率检测结果表明: 这2个落叶松扦插生根过程差异表达cDNA 文库构建成功。利用PCR扩增和点杂交试验筛选阳性克隆, 将阳性克隆测序, 并经生物信息学分析, 最终获得521个Un iEST。

以落叶松体细胞胚胎发育8个阶段的材料构建小RNA文库,进行了Solexa测序、miRNA鉴定、靶基因预测、qRT-PCR定量分析等研究。结果表明:发现的87个miRNAs中,29个为针叶树特异的,来自12个家族,分别为miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311、miR1312、miR1313、miR1314、miR1316、miR3701、miR3702和miR3704,其中25个长度为22nt,且在小RNA文库中的最低拷贝数为18(miR1311),最高拷贝数为33 009(miR950)。发现12个miRNA家族的34个靶基因可能参与生长发育、抗病、AGO反馈调节等多方面遗传调控;qRT-PCR分析表明:72% miRNAs表达次高峰在后期单胚或早期子叶胚,在中期子叶胚最低,最高峰在后期子叶胚,分别与子叶形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活动相吻合,而miRNA前体的表达模式不同于miRNA,前体变化幅度小于成熟体。

运用qRT-PCR技术,检测日本落叶松种子萌发过程中的5个阶段——干种子 (萌发培养0 d)、吸胀(1 d)、萌动(5 d)、胚根外露(9 d)和子叶展开(28 d),miR156、miR159和miR160等18个miRNAs在其种胚内的表达模式,并对其目标基因进行生物信息学分析,探讨miRNA在针叶林木种子萌发过程中的基因表达模式。结果表明:(1)从整个萌发过程分析,18个miRNAs的表达水平皆以干种子阶段最高,吸胀和萌动阶段迅速下降;干种子阶段的表达水平分别是吸胀、萌动、胚根外露和子叶展开阶段的4.8 43.5、17.2 1 000.0、45.5 1 000.0、62.5 1 862.2倍。(2)从各个阶段分析,miR894的表达水平在5个阶段均最高,miR408均最低;其余16个miRNAs在5个阶段内的表达水平各有变化,综合排序结果从高到低依次为:miR951、miR950、miR156、miR159、miR396、miR398、miR390、miR160、miR947、miR165、miR319、miR162、miR171、miR397、miR395和miR172。(3)miRNA目标基因预测结果显示:目标基因主要是ATP/DNA结合蛋白、ARF等转录因子、质膜和核糖体等细胞组分及MAP等激酶活性蛋白等蛋白编码基因。(4)miR160对其目标基因JR160237 具有切割作用,切割位点发生在miR160与目标基因互补结合位点第10与11位碱基之间。JR160237在种子吸胀阶段表达水平迅速升高,在萌动、胚根外露和成苗阶段有所回落。